Tema central: controles experimentais em citometria de fluxo multiparamétrica, fundamentais para definir portas (gates), ajustar compensação espectral e verificar artefatos como reatividade inespecífica (p.ex., ligação via receptores Fc).

Gabarito: C — Controle isotípico.

Justificativa da correta (C): O controle isotípico utiliza um anticorpo do mesmo isótipo, espécie e fluorocromo do anticorpo teste, mas sem especificidade para o antígeno. Ele foi muito usado para definir positividade, porém as diretrizes atuais desencorajam esse uso de rotina porque não reflete adequadamente autofluorescência, “spillover” nem o contexto do painel. Ainda assim, permanece útil para detectar ligação inespecífica quando o bloqueio (ex.: anti-Fc) pode estar ineficiente — exatamente o “EXCETO” do enunciado. Referências: ISAC/ICCS/ICSH; Shapiro, Practical Flow Cytometry; Cossarizza et al., Eur J Immunol 2021.

Análise das alternativas incorretas:

• A) FMO (Fluorescence Minus One): controle moderno e indispensável para definir limites de positividade em painéis multicolor, pois mede o espalhamento de sinal dos demais marcadores sobre o canal de interesse. Não foi abandonado; é o padrão recomendado (Perfetto et al., Nat Rev Immunol).
• B) Compensação: controles de compensação (tubos “single-stain”, geralmente com beads) são obrigatórios para corrigir sobreposição espectral entre fluorocromos. Não se enquadram como “não mais empregados”.
• D) Proposto na bula do fabricante: não é um tipo específico de controle, mas orientações de execução (p.ex., controle positivo/negativo, titulação). Essas recomendações continuam válidas e não correspondem ao “controle que caiu em desuso”.
• E) Células não marcadas (unstained): seguem úteis para ajustar tensões, avaliar autofluorescência e background basal. Também não foram abandonadas.

Estratégia de prova: destaque o termo “EXCETO” e as palavras-chave “reatividade inespecífica”. Entre os controles listados, o único amplamente desaconselhado para gate/positividade, mas ainda válido para checar bloqueio ineficiente, é o isotípico. Para gates, pense sempre em FMO; para espectros, em compensação; para baseline, em unstained.

Fontes úteis: ISAC/ICCS/ICSH guidelines; Shapiro HM. Practical Flow Cytometry; Cossarizza A et al., Eur J Immunol 2021; UpToDate – Principles of flow cytometry.

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