Tema central: O fluxo de trabalho do NGS divide-se em análise primária (base calling, demultiplexação e controle de qualidade), secundária (alinhamento/assemblagem e chamada de variantes) e terciária (anotação/interpretação, estatística, expressão gênica). Reconhecer essas fases é essencial em Controle de Qualidade de Laboratório Clínico, pois cada etapa tem métricas e formatos de arquivo específicos.

Alternativa correta: D
Justificativa: A análise primária é executada no software do instrumento (ex.: Illumina bcl2fastq/DRAGEN), realizando base calling, demultiplexação, filtragem/corte (trimming) e registrando qualidade por base em valores Phred. O resultado é salvo em arquivos FASTQ, que contêm as sequências e suas qualidades. Esse é o padrão descrito por fabricantes e pela literatura de referência (Ewing & Green, Genome Res; Cock et al., NAR 2010; GATK Best Practices, Broad Institute).

Por que as demais estão incorretas?

A – “alinhamento de leitura com arquivo BRF”: alinhamento é etapa secundária, não primária. Além disso, “BRF” não é formato padrão em NGS. Os formatos usuais são FASTQ (entrada), SAM/BAM/CRAM (pós-alinhamento) (Li et al., Bioinformatics 2009).

B – “alinhamento pelo edgeR/DESeq2”: edgeR e DESeq2 são pacotes de análise diferencial de expressão (RNA-Seq), usados na fase terciária. Não fazem alinhamento e não compõem a análise primária (Love et al., Genome Biol 2014).

C – “RSEM com arquivo BAM”: O RSEM estima abundância transcricional após alinhamento/pseudoalinhamento; utiliza BAM ou FASTQ e pertence a etapas secundária/terciária, não à primária. Além disso, BAM é gerado após alinhamento, o que ocorre depois da primária.

E – “DESeq2 com arquivo BAM”: DESeq2 opera sobre matrizes de contagem, não sobre BAM diretamente, e é terciário (estatística e interpretação), não primário.

Dicas para a prova:
- Associe FASTQ + Phred + base calling à análise primária e software do sequenciador.
- Pense em alinhamento + BAM/SAM + variantes como análise secundária.
- Lembre de DESeq2/edgeR, anotação e interpretação como terciária.

Referências úteis: Illumina DRAGEN/bcl2fastq docs; Cock et al. NAR 2010 (FASTQ); Li et al. Bioinformatics 2009 (SAM/BAM); Broad Institute GATK Best Practices; Love et al. Genome Biol 2014 (DESeq2).

Gabarito: D

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