Tema central: identificação e quantificação de vírus com genoma de RNA. Para RNA, é indispensável a etapa de transcrição reversa; para quantificar, é necessário detecção em tempo real.

Alternativa correta: E — RT‑qPCR (Transcriptase reversa + Real Time)

O fluxo é: extração do RNA viral → RT (conversão para cDNA) → qPCR em tempo real com fluorescência (SYBR Green ou sondas TaqMan). O equipamento mede o sinal a cada ciclo e gera o Ct/Cq, que se correlaciona com a carga viral; com curva-padrão, permite quantificação absoluta (cópias/mL) ou relativa. É o método recomendado por diretrizes internacionais para monitorar vírus de RNA (ex.: SARS‑CoV‑2, influenza, HCV) por combinar especificidade, sensibilidade e quantificação (OMS/WHO Laboratory testing guidance; CDC real-time RT‑PCR protocols; diretrizes MIQE; UpToDate).

Análise das alternativas incorretas

A — Multiplex PCR: “Multiplex” apenas indica vários alvos no mesmo ensaio. Não implica transcrição reversa nem leitura em tempo real. Sem RT, não detecta RNA; sem “Real Time”, não quantifica. Poderia existir “RT‑qPCR multiplex”, mas não é o que está descrito.

B — RT‑PCR (transcriptase reversa): Inclui a RT (bom para RNA), porém, na forma convencional (endpoint) é essencialmente qualitativa (presença/ausência) por eletroforese; é, no máximo, semiquantitativa e sujeita ao plateau da reação, não sendo adequada para quantificação confiável.

C — Nested PCR: Duas rodadas para aumentar sensibilidade e especificidade, mas continua sendo qualitativa e eleva risco de contaminação cruzada. Também não contempla, por si só, a RT nem a detecção em tempo real.

D — PCR Hot Start: Modificação que reduz amplificação inespecífica ao ativar a polimerase em alta temperatura. Não adiciona RT nem quantificação. É um ajuste de performance, não um método de escolha para RNA quantificado.

Estratégia de prova: achou as palavras‑chave RNA + quantificação? Procure RT (para RNA) + qPCR/Real Time (para quantificar). Se faltar qualquer um desses dois componentes, a opção não atende ao enunciado.

Termos úteis: Ct/Cq = ciclo no qual a fluorescência ultrapassa o limiar; Sonda TaqMan aumenta especificidade; Curva-padrão permite quantificação absoluta.

Referências-chave: WHO Laboratory testing for coronavirus disease; CDC Real-time RT‑PCR diagnostic protocols; MIQE Guidelines (Bustin et al.); UpToDate (Principles of RT‑qPCR).

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Se é método de identificação de material genético viral, utiliza-se o RT-PCR, em que a enzima Transcriptase Reversa vai produzir uma fita de DNA complementar ao RNA.

Para quantificar, utiliza-se o PCRq - PCR em tempo real, um método que utiliza da fluorescência para reproduzir valores exatos e diretamente proporcionais aos produtos de PCR.

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