Tema central: Sequenciamento automático de Sanger (dye-terminator). Envolve: fita molde de DNA, um único primer, mistura de dNTPs + ddNTPs fluorescentes, terminação aleatória da cadeia, eletroforese capilar, leitura por detector de fluorescência e armazenamento do cromatograma/base calling.

Alternativa correta: B

Está na sequência técnica correta: (1) desnaturação do DNA dupla-fita; (2) anelamento de um primer específico; (3) polimerização com dNTPs e ddNTPs marcados; (4) interrupção onde um ddNTP é incorporado (ddNTP não tem 3’-OH → impede extensão); (5) eletroforese capilar separa os fragmentos por tamanho; (6) detecção por fluorescência (laser); (7) armazenamento/análise no computador (cromatograma). Essa é a descrição clássica do método automatizado de Sanger com dye-terminators (Applied Biosystems/BigDye), conforme Green & Sambrook, Molecular Cloning, 4ª ed., e Alberts, Molecular Biology of the Cell.

Por que as demais estão incorretas?

A) Descreve prática de PCR + gel de agarose (2%) com brometo de etídio e UV, não Sanger automatizado. Não usa ddNTPs, logo não há terminação de cadeia; apenas visualização de amplicon por gel.

C) Inicia com RNA e transcriptase reversa (RT): isso é RT para gerar cDNA, não a etapa de Sanger em si. Além disso, afirma interrupção por dNTPs (falso: quem interrompe são os ddNTPs).

D) Cita par de primers + sonda de hidrólise fluorescente (TaqMan), típica de qPCR, não de Sanger. Em Sanger usa-se um primer e não se empregam sondas de hidrólise.

E) Embora descreva ddNTPs, erra ao usar par de primers. Sequenciamento Sanger emprega um único primer para gerar uma escada de fragmentos aninhados; dois primers caracterizam PCR.

Estratégia para a prova

• Marque como Sanger quando vir: um primer + ddNTPs fluorescentes + eletroforese capilar + detecção por fluorescência.
• Desconfie de: gel de agarose + EtBr/UV (rotina de PCR), sondas TaqMan (qPCR) e RNA + RT (etapa de cDNA, não o sequenciamento).

Conceitos-chave

• ddNTP: nucleotídeo sem 3’-OH → causa terminação da cadeia quando incorporado.
• Eletroforese capilar: separa fragmentos com alta resolução, permitindo leitura base a base.
• Cromatograma: picos de fluorescência por cor (A, C, G, T) usados no base calling.

Referências úteis: Green & Sambrook, Molecular Cloning (CSH, 2012); Alberts et al., Molecular Biology of the Cell; Applied Biosystems BigDye Terminator v3.1 Protocol; revisão em Nature Methods sobre Sanger. Para visão clínica-laboratorial integrada, ver UpToDate: Overview of DNA sequencing technologies.

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