O protocolo padrão para a realização dos testes de disco-difusão envolve semeadura do material clínico diretamente na placa de ágar Müeller-Hinton, sendo possível testar os diferentes tipos de microrganismos em uma mesma placa do teste de sensibilidade.

Só podem ser obtidos resultados confiáveis com testes de disco-difusão que usam o princípio da metodologia padronizada e medidas do diâmetro do halo de inibição correlacionados às concentrações inibitórias mínimas com cepas reconhecidamente sensíveis e resistentes a diversos agentes microbianos.

Os testes de disco-difusão baseados apenas na presença ou ausência de um halo de inibição são considerados apropriados para avaliação da sensibilidade de bactérias anaeróbias aos antibióticos.

Após a dispensação dos discos antimicrobianos na superfície de uma placa de ágar semeada, as placas devem ser colocadas em uma estufa de CO₂ , a 40 ºC, por pelo menos 48 horas, para que então possam ser examinadas.

Os diâmetros dos halos de inibição nos testes de disco-difusão refletem apenas aspectos qualitativos e não estão diretamente correlacionados às concentrações inibitórias mínimas dos testes de diluição padronizados.