A sífilis é diagnosticada laboratorialmente pela cultura bacteriana direta de Treponema pallidum a partir de lesões primárias ou secundárias, sendo este o método padrão-ouro para a detecção da infecção.

Para o diagnóstico de sífilis, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é o método de escolha para a detecção de Treponema pallidum em todos os estágios da infecção, substituindo os testes sorológicos devido à sua maior sensibilidade e especificidade.

O diagnóstico laboratorial da sífilis é confirmado exclusivamente pelo teste rápido de detecção de anticorpos, que, uma vez positivo, dispensa a necessidade de qualquer outro exame para a confirmação da infecção ativa. 

O diagnóstico de sífilis é realizado inicialmente por meio de testes não treponêmicos, como o VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) ou RPR (Rapid Plasma Reagin), que detectam anticorpos anticardiolipina. Estes testes são utilizados para triagem e monitoramento da resposta ao tratamento, sendo necessário um teste treponêmico, como o FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibody Absorption) ou o teste rápido treponêmico, para confirmação do diagnóstico.