Tema central: Normalização em RNA-Seq é o processo que torna os valores de expressão comparáveis entre amostras e genes, corrigindo vieses técnicos. O viés mais importante decorre da profundidade de sequenciamento (tamanho da biblioteca) e do tamanho dos transcritos (genes maiores acumulam mais leituras).

Alternativa correta: A — Ajustar para diferenças na profundidade de sequenciamento e no tamanho dos transcritos.

Justificativa: Sem normalização, uma amostra com mais leituras aparenta ter maior expressão global, e genes longos parecem mais expressos apenas por terem mais bases para capturar reads. Métodos como RPKM/FPKM e especialmente TPM corrigem por tamanho do gene e tamanho da biblioteca. Para análises entre amostras, pacotes como DESeq2 (fatores de tamanho) e edgeR/TMM corrigem principalmente a profundidade/composição da biblioteca. Assim, o propósito primário é garantir comparabilidade dos níveis de expressão, removendo esses vieses sistemáticos.

Por que as demais estão incorretas?

B — “Remover duplicatas de PCR”: isso é um passo de controle de qualidade (deduplicação), muitas vezes baseado em UMIs. Não é a normalização; e mesmo após deduplicar, ainda é preciso normalizar por profundidade e comprimento.

C — “Identificar transcritos diferencialmente expressos”: a identificação de DE é etapa estatística posterior (modelos NB em DESeq2, edgeR, limma-voom). A normalização é pré-requisito, mas não realiza a detecção por si só.

D — “Alinhar às referências”: alinhamento/mapeamento (ex.: STAR, HISAT2) é etapa anterior para atribuir reads a genes/transcritos. Normalização ocorre após a contagem, com outro objetivo.

E — “Identificar isoformas diferencialmente expressas”: exige quantificação a nível de transcrito (ex.: Salmon, Kallisto) e testes específicos (ex.: Sleuth, DEXSeq/DRIMSeq). Normalizar ajuda, mas não é o propósito primário nem suficiente para essa tarefa.

Estratégia para a prova: Ao ver “propósito primário” e “RNA-Seq”, associe imediatamente a “tornar comparável” e às palavras-chave profundidade e comprimento. Desconfie de opções que descrevem outras etapas do pipeline (alinhamento, deduplicação, DE).

Referências essenciais: - Conesa A et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol, 2016. - Love MI et al. DESeq2. Genome Biol, 2014. - Robinson MD & Oshlack A. TMM normalization. Genome Biol, 2010.

Gabarito: A

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