Tema central: obtenção de anticorpos monoclonais por hibridomas. Após a fusão de linfócitos B com células de mieloma (selecionadas em meio HAT), é essencial clonar as linhagens para garantir que cada poço derive de uma única célula, produzindo um único anticorpo (mesma especificidade e epítopo).

Alternativa correta: B — Diluição limitante até 1 célula/poço, confirmação microscópica, expansão e triagem do sobrenadante por ELISA. Este é o procedimento clássico para assegurar monoclonalidade e especificidade: cada clone cresce isoladamente e o anticorpo secretado é testado contra o antígeno-alvo. Referências: Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual; Current Protocols in Immunology; UpToDate (produção de anticorpos monoclonais); Köhler & Milstein, Nature 1975.

Por que funciona? A diluição limitante usa estatística de Poisson para isolar uma célula por poço. O ELISA no sobrenadante detecta anticorpo funcional e sua especificidade contra o antígeno-alvo, confirmando que o clone é adequado. Frequentemente realiza-se reclonagem para reforçar a monoclonalidade.

Análise das incorretas

A — PFGE de DNA genômico não informa sobre a especificidade do anticorpo nem garante monoclonalidade. Rearranjos de Ig requerem RT-PCR/seq das regiões V(D)J e, ainda assim, isso não substitui o isolamento por célula única e teste funcional.

C — Espectrometria de massa identifica proteínas, mas com mistura de clones o espectro é composto e não assegura monoclonalidade. Iniciar novo ciclo de imunização é inadequado e desnecessário; o problema é de clonagem, não de imunização.

D — Trocar meio por PBS provoca morte celular inespecífica; não é método de clonagem. Além disso, fazer PCR do sobrenadante é incorreto (anticorpos são proteínas, não ácidos nucleicos). Mesmo PCR em células não comprova funcionalidade/especificidade.

E — Imunocromatografia não permite isolar uma única célula de hibridoma nem mapear epítopos com precisão; é teste de detecção rápida, não de clonagem e seleção de hibridomas específicos.

Estratégia para a prova

• Procure termos-chave: “diluição limitante” + “1 célula/poço” + “ELISA do sobrenadante”.
• Desconfie de métodos que não avaliam funcionalidade do anticorpo (DNA/PCR) ou que não isolam célula única (imunocromatografia, MS).
• Lembre: confirmação visual do número de células por poço e, se necessário, reclonagem.

Resumo: Para garantir anticorpos monoclonais e específicos a partir de hibridomas, realiza-se diluição limitante, confirma-se uma célula por poço e seleciona-se o clone por ELISA. Isso alinha-se aos manuais clássicos e protocolos atuais de imunologia laboratorial.

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