Pelo Tratado, os portugueses tiveram que ceder a região de Sete Povos das Missões aos espanhóis que, por sua vez, terminaram por compensar os portugueses com a Colônia de Sacramento, atualmente parte integrante do estado do Rio Grande do Sul.

Apesar de algumas peculiaridades envolvendo a Colônia de Sacramento e Sete Povos das Missões, o Tratado consagrou o princípio do uti possidetes, ita possideatis ("quem possui de fato, deve possuir de direito") proveniente do direito romano, que contribuiu para delinear os contornos territoriais aproximados do Brasil de hoje. 

Uma das consequências do Tratado de Madri, que finalizou o período de vigência do Tratado de Tordesilhas de 1494, foi a chamada Guerra Guaranítica, que envolveu jesuítas, indígenas, portugueses e espanhóis em função de Sete Povos das Missões.

Apesar do Tratado de Madri ter delineado aproximadamente os contornos territoriais do Brasil atual, o território que compõe o Acre só veio a ser agregado ao País no início do século XX, após um tratado com a Bolívia.