A lactose é um dissacarídeo formado por glicose e galactose com união α 1-4 e sintetizado exclusivamente na glândula mamária ativa. A síntese é realizada nos ribossomos das células do epitélio mamário.

As moléculas precursoras de lactose, glicose e galactose, provêm principalmente da glicose sanguínea ou de substâncias rapidamente conversíveis em glicose, através da via gliconeogênica, tais como o propionato, o piruvato, o oxalacetato e os ácidos graxos de cadeia longa.

Toda glicose que chega à glândula mamária é direcionada para síntese de lactose, e todo glicerol, para a síntese dos triglicerídeos do leite. O glicerol é obtido da di-hidroxiacetona-P (via glicolítica).

 A secreção de caseína para o alvéolo mamário determina a quantidade de água no leite; por osmose, a síntese de caseína é um dos fatores determinantes na produção total de leite. A disponibilidade de propionato sanguíneo e a capacidade de realizar síntese proteica pela glândula mamária constituem fatores limitantes para a produção de leite. 

A enzima que sintetiza a lactose é um complexo chamado lactose sintetase, composto de duas proteínas: galactosil-transferase, presente no aparelho de Golgi da célula epitelial mamária e de outros tecidos, e α-lactoalbumina, proteína presente em altas concentrações no leite.