Ligam-se, de maneira reversível, à porção 30S do ribossoma, bloqueando a ligação do RNA transportador, impedindo a síntese protéica.

Sua ação ocorre por meio da inibição da síntese proteica dependente de RNA, por meio da ligação em receptores localizados, na porção 50S do ribossoma, particularmente, na molécula 23S do RNA, impedindo as reações de transpeptidação e translocação.

Inibem a atividade da DNA girase ou topoisomerase II, enzima essencial à sobrevivência bacteriana. A DNA girase torna a molécula de DNA, compacta e biologicamente, ativa. Ao inibir essa enzima, a molécula de DNA passa a ocupar grande espaço, no interior da bactéria e suas extremidades livres determinam síntese descontrolada de RNA mensageiro e de proteínas, determinando a morte das bactérias. 

Interagem com a molécula de polissacarídeo da membrana externa das bactérias gram-negativas, retirando cálcio e magnésio, necessários para a estabilidade da molécula de polissacarídeo. Esse processo é independente da entrada do antimicrobiano, na célula bacteriana e resulta em aumento de permeabilidade da membrana com rápida perda de conteúdo celular e morte da bactéria.

A CsA e o FK506, com base no sítio de ação imunorregulatório, são classificados como inibidores da transcrição do primeiro sinal para ativação do linfócito T.