No Brasil, a cocirculação de diferentes arbovírus reforça a necessidade do desenvolvimento de protocolos
de diagnóstico molecular rápidos, específi cos, sensíveis e
que permitam a detecção, sempre que possível, de mais
de um arbovírus na mesma reação. Dentre os protocolos
de amplificação do genoma viral, as técnicas em tempo
real apresentam vantagens neste contexto, principalmente
quando utilizam sondas marcadas com fluoróforos. Sobre a
técnica supracitada, avalie se são verdadeiras (V) ou falsas
(F) as afirmativas a seguir:
I. As sondas são marcadas com uma molécula que emite
fluorescência (quencher) numa extremidade e com
uma molécula que absorve a fluorescência (reporter)
na outra extremidade.
II. Em um protocolo para alvos múltiplos (multiplex) numa
mesma reação, as sondas específi cas para cada sequência genômica poderão ser marcadas com a mesma
molécula repórter, necessitando somente de moléculas
quencher distintas.
III. Durante o desenho dos oligonucleotídeos, a região de
hibridização da sonda deve estar localizada à montante
da região de hibridização do primer sense (forward).
As afirmativas I, II e III são, respectivamente:

Question

No Brasil, a cocirculação de diferentes arbovírus reforça a necessidade do desenvolvimento de protocolos
de diagnóstico molecular rápidos, específi cos, sensíveis e
que permitam a detecção, sempre que possível, de mais
de um arbovírus na mesma reação. Dentre os protocolos
de amplificação do genoma viral, as técnicas em tempo
real apresentam vantagens neste contexto, principalmente
quando utilizam sondas marcadas com fluoróforos. Sobre a
técnica supracitada, avalie se são verdadeiras (V) ou falsas
(F) as afirmativas a seguir:
I. As sondas são marcadas com uma molécula que emite
fluorescência (quencher) numa extremidade e com
uma molécula que absorve a fluorescência (reporter)
na outra extremidade.
II. Em um protocolo para alvos múltiplos (multiplex) numa
mesma reação, as sondas específi cas para cada sequência genômica poderão ser marcadas com a mesma
molécula repórter, necessitando somente de moléculas
quencher distintas.
III. Durante o desenho dos oligonucleotídeos, a região de
hibridização da sonda deve estar localizada à montante
da região de hibridização do primer sense (forward).
As afirmativas I, II e III são, respectivamente: Alternativa A: F, F e V.  Ou Alternativa B: F, F e F.  Ou Alternativa C: V, V e V.  Ou Alternativa D: F, V e F.  Ou Alternativa E: V, V e F.

Qconcursos · Accepted Answer

Alternativa [B] F, F e F.  Tema central: Diagnóstico molecular por RT-qPCR (tempo real) com sondas fluorescentes tipo TaqMan, recurso-chave no cenário de cocirculação de arbovírus por permitir alta sensibilidade, especificidade e multiplexação.

Gabarito: B — F, F, F.

I — Falsa. Em sondas TaqMan, a extremidade 5’ recebe o reporter (dye que emite fluorescência) e a 3’ recebe o quencher (molécula que absorve/abafa a emissão do reporter por FRET). Durante a extensão, a atividade exonuclease 5’→3’ da polimerase cliva a sonda, separa reporter do quencher e a fluorescência aumenta proporcionalmente ao produto gerado. A afirmativa inverteu as funções de reporter e quencher. (Referências: Diretrizes MIQE; Applied Biosystems TaqMan Assay Design; UpToDate, Real-time PCR.)

II — Falsa. Em reações multiplex, cada alvo deve usar diferentes reporters com espectros distintos (ex.: FAM, HEX/VIC, Texas Red, Cy5), permitindo a leitura em canais separados. Os quenchers podem ser do mesmo tipo (p.ex., NFQ/BHQ compatíveis com o reporter) e não servem para diferenciar alvos, pois não emitem. Afirmar que se pode usar o mesmo reporter e apenas variar quenchers é incorreto. (MIQE; CDC/PAHO protocolos de RT-qPCR para dengue/Zika/chikungunya.)

III — Falsa. A sonda deve hibridizar dentro do amplicon, à jusante (downstream) do sítio do primer forward na fita que a polimerase está copiando, para que a enzima encontre e clive a sonda durante a extensão. Colocar a sonda à montante (upstream) do primer forward a deixaria fora da trajetória da polimerase, frustrando a detecção. (Applied Biosystems; MIQE.)

Por que a alternativa B é a correta? Porque as três proposições estão incorretas. Logo, qualquer opção que contenha “V” (A, C, D, E) não corresponde ao padrão verdadeiro/falso adequado.

Dicas para a prova (pegadinhas clássicas):

Reporter (emite) x Quencher (abafa): funções nunca se invertem.
  Multiplex: diferenciação por reporters distintos, não por quenchers.
  Posicionamento da sonda: sempre entre os primers, downstream do forward, para ser clivada durante a extensão.

Fontes úteis: MIQE Guidelines (Bustin et al., Clin Chem 2009); UpToDate – Principles of quantitative real-time PCR; Applied Biosystems TaqMan Design Guides; PAHO/OMS – Guias laboratoriais para diagnóstico molecular de arboviroses.

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