Tema central: RT-PCR/PCR e suas etapas no termociclador. Em PCR, o DNA é amplificado em ciclos repetidos de desnaturação, anelamento (annealing) e extensão. Na RT-PCR, há etapa prévia de transcrição reversa (RNA → cDNA) antes da PCR.

Alternativa correta: A — O anelamento (annealing) é uma hibridação específica entre o primer e a fita molde, determinada pela temperatura de melting (Tm) do primer e pela sua complementaridade. Essa etapa confere especificidade à reação. Ajuste adequado da temperatura de anelamento reduz amplificações inespecíficas e dímeros de primer. Referência: Molecular Cloning (Sambrook), UpToDate (Polymerase chain reaction: principles).

Por que as demais estão incorretas:

B — PCR convencional requer dois primers (forward e reverse) flanqueando a região-alvo, para síntese bidirecional. Em RT, pode-se usar oligo(dT), hexâmeros aleatórios ou primer específico, mas a etapa de PCR subsequente ainda utiliza par de primers. Diretrizes laboratoriais CDC/OMS para RT-PCR diagnóstica reforçam o uso de pares de primers específicos.

C — Não são “3 ciclos”. A PCR realiza 3 etapas por ciclo, e o número de ciclos é tipicamente 25–45, dependendo da abundância do alvo e da sensibilidade desejada. Provas costumam confundir “etapas” com “ciclos”: atenção a essa pegadinha.

D — A redação é imprecisa. Embora polimerases sem proofreading (ex.: Taq) tenham taxa de erro baixa mas não nula, a premissa da PCR não é “induzir mutações”; em diagnóstico, usa-se condições e/ou polimerases (hot-start, alta fidelidade) para minimizar erros, de modo que o DNA neo-sintetizado não deve “sofrer mutações” como regra do processo. Em contexto de prova, a afirmação generaliza um evento raro e indesejado. Referência: UpToDate; fabricantes de polimerases (Pfu/Phusion) reportam taxas de erro significativamente menores que Taq.

E — Existem várias polimerases termoestáveis (Taq, Pfu, Phusion, Q5, Tth), cada uma com características específicas (fidelidade, velocidade, tolerância a GC/inibidores). Além disso, não devem ser usadas indiscriminadamente; a escolha depende do objetivo (diagnóstico, clonagem, high-fidelity, amplicons longos). A afirmação nega a diversidade e sugere uso indiscriminado, ambos incorretos. Referência: manuais de fabricantes e Molecular Biology of the Gene (Watson).

Estratégia para futuras questões: - Lembre-se da tríade da PCR: desnaturação–anelamento–extensão (etapas) e dos 25–45 ciclos. - PCR usa 2 primers. RT-PCR inclui a etapa de transcrição reversa. - Verifique o papel do annealing como hibridação específica e a escolha da polimerase conforme a finalidade.

Leituras úteis: UpToDate (Principles of PCR), CDC/OMS protocolos de RT-PCR (ex.: SARS-CoV-2), Sambrook & Russell – Molecular Cloning.

Gabarito: A

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