Tema central: Na análise do ciclo celular por citometria de fluxo, o iodeto de propídio (PI) intercalado ao DNA é usado para quantificar o conteúdo de DNA. Contudo, o PI também se liga ao RNA, gerando ruído e distorções nas fases G0/G1, S e G2/M. Para eliminar essa interferência, é necessário remover o RNA antes ou durante a coloração.

Alternativa correta: D – RNase

Justificativa: A RNase (geralmente RNase A livre de DNase) degrada especificamente o RNA, impedindo sua ligação ao PI e garantindo que o sinal medido corresponda apenas ao DNA. Protocolos consagrados recomendam incubar as amostras com RNase A (≈50–100 µg/mL) por 15–30 min a 37°C, frequentemente em conjunto com um detergente para permeabilização. Essa é a abordagem padrão descrita em referências como Practical Flow Cytometry (Shapiro), Current Protocols in Cytometry e guias da BD/Invitrogen.

Estratégia de prova: Quando a pergunta aborda “PI liga-se também ao RNA” e pede como “evitar interferências”, busque o reagente que remove RNA. Detergentes (NP-40, Triton) apenas permeabilizam; tampões (PBS) e água não degradam RNA. Logo, a resposta é a enzima RNase.

Análise das alternativas incorretas

• A – NP-40: Detergente não iônico usado para permeabilizar membranas, facilitando a entrada do PI. Não degrada RNA, portanto não previne a ligação do PI ao RNA. Útil no preparo, mas insuficiente para o problema descrito.
• B – Triton X-100: Função idêntica ao NP-40 (permeabilização). Sem atividade enzimática sobre RNA. Se usado sem RNase, persiste a interferência do RNA na fluorescência do PI.
• C – H2O: Pode causar lise hipotônica, mas não degrada RNA. Além disso, compromete a integridade celular e a análise de ciclo celular.
• E – PBS: Tampão isotônico que mantém pH e osmolaridade. Não tem ação sobre ácidos nucleicos; apenas dilui e lava. Não resolve a interferência do RNA.

Dica prática: Use RNase A livre de DNase para não degradar o DNA-alvo. A fixação etanólica (70%) e a permeabilização com NP-40/Triton são etapas comuns, mas somente a RNase elimina o sinal de RNA do PI.

Referências essenciais: Shapiro HM. Practical Flow Cytometry; Darzynkiewicz et al., Methods in Cell Biology; Current Protocols in Cytometry; protocolos BD Biosciences/Invitrogen sobre PI/RNase para análise de ciclo celular.

Gabarito: D – RNase.

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