A alternativa correta é a C) Durante a palestra, os estudantes fizeram perguntas.

O termo "Durante a palestra" é um adjunto adverbial de tempo de grande extensão. Como ele foi deslocado para o início da frase (fora da sua ordem natural, que seria no final), a vírgula é obrigatória.

Ordem Invertida (Obrigatória): Quando o adjunto adverbial é deslocado para o início ou para o meio da frase, ele quebra a ordem direta. Por ser uma expressão de grande extensão (três ou mais palavras), a vírgula torna-se obrigatória para marcar essa pausa e facilitar a leitura.