A anfotericina B tem como a inibição da desmetilação da 140-lanosterol, essencial para biossíntese de ergosterol.

A anfotericina b tem como alvo parede celular, inibindo a síntese de beta (1,3) glucana, resultando assim em um desequilíbrio osmótico prejudicando o microrganismo. A distribuição de proteínas e hidratos de carbono estão relacionados à parede celular e aos processos osmose e de lise, pois é nela que o antifúngico vai agir inibindo a síntese de glucanas pela inativação da enzima 1,3-beta-glucana

A anfotericina B interage com o ergosterol, que constitui o principal esterol da membrana plasmática fúngica, alterando a permeabilidade seletiva desta por originar poros permeáveis à saída de água e de pequenas moléculas essenciais à sobrevivência do microrganismo, especialmente íons de potássio, amônio e fosfato.

A anfotericina B penetra com facilidade na célula fúngica por intermédio da citocina aminase e em seguida será convertida em 5- fluororacil considerado um falso nucleotídeo, como mostra na figura abaixo. Este por sua vez, inibe a enzima timidilatosintetase, que é o componente essencial do DNA, ausente nas células eucarióticas humanas e por isso apresenta poucos efeitos colaterais