Tema central: validação de variantes detectadas por NGS quando há baixa cobertura (poucas leituras no locus). Cobertura insuficiente aumenta risco de falsos positivos/negativos por erros de sequenciamento, alinhamento ou viés de fita.

Gabarito correto: B — “Validar por um segundo método”. Em NGS clínico, variantes com métricas frágeis (baixa profundidade, baixa qualidade de base/mapeamento, viés de strand, VAF atípica) devem ser confirmadas por método ortogonal (p.ex., Sanger, qPCR/HRM, ddPCR, ou targeted resequencing). Essa prática está alinhada a recomendações de laboratórios clínicos e sociedades como ACMG/AMP e CAP, que indicam confirmação para chamadas que não atingem limiares de qualidade estabelecidos (germline usualmente ≥20–30x; somáticas frequentemente ≥100–500x, conforme o painel e VAF esperada). Confirmar evita tanto reportar erro quanto perder uma variante clinicamente relevante.

Como pensar na prova: ao identificar “baixa cobertura”, procure a ação que reduz incerteza técnica antes de concluir; “validar/confirmar” é a conduta segura. Evite extremos como “ignorar” ou “descartar” sem verificação.

Por que as outras alternativas estão incorretas?

• A) Revisar o arquivo FASTQ: revisar leituras brutas e o QC (qualidade de base, adaptadores) é útil, mas não resolve a baixa cobertura naquele locus nem confirma a existência da variante. Pode orientar um reseq, mas não substitui validação.
• C) Revisar o arquivo BWA: o BWA é um aligner; ele gera SAM/BAM (não há “arquivo BWA”). Inspecionar o BAM no IGV pode mostrar artefatos, porém continua insuficiente para confirmar uma variante de baixa cobertura.
• D) Descartar a variante: baixa cobertura ≠ variante falsa. Descartar sem tentar confirmar pode causar falso-negativo clinicamente relevante. Diretrizes recomendam confirmação ou novo sequenciamento, não descarte automático.
• E) Continuar a análise ignorando cobertura: cobertura é um critério crítico de qualidade. Ignorá-la contraria boas práticas (limiares de profundidade, qualidade de mapeamento, balanceamento de fita e VAF) e aumenta o risco de erro.

Resumo prático: variante com pouca leitura deve ser confirmada por método ortogonal ou re-sequenciada com profundidade adequada antes de qualquer conclusão clínica.

Referências essenciais: ACMG/AMP – diretrizes de interpretação e prática laboratorial; CAP – recomendações para confirmação ortogonal em NGS clínico; práticas consolidadas de validação em laboratórios acreditados (ISO 15189). Ver também revisões em UpToDate sobre “Overview of NGS in the clinical laboratory”.

Resposta correta: B.

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