São utilizados os reagentes cristal de violeta, lugol, álcool-cetona e fucsina básica, nesta ordem.

O lugol é utilizado como mordente, formando um complexo com o corante, insolúvel em água, que se fixa a parede celular das bactérias.

A fucsina básica serve como corante primário, se complexa com o iodo e dá a cor característica das bactérias Gram positivas.

A etapa de descoloração com solvente orgânico álcool-cetona é crítica, já que o prolongamento da exposição pode provocar a descoloração até mesmo dos microrganismos Gram positivos, gerando a visualização falsa de Gram negativo.

Pode-se distinguir as bactérias que adquirem coloração rosada (Gram negativas) e as de coloração púrpura (Gram positivas).