No uso da técnica de citometria de fluxo e seleção de
fluorocromos, considera-se a ocorrência da excitação dos
fluorocromos por uma radiação laser ao emitir um comprimento de onda (cor), que é detectado por um sensor,
chamado de fotomultiplicadores. Sobre este processo, pode se
dizer que:

Question

No uso da técnica de citometria de fluxo e seleção de
fluorocromos, considera-se a ocorrência da excitação dos
fluorocromos por uma radiação laser ao emitir um comprimento de onda (cor), que é detectado por um sensor,
chamado de fotomultiplicadores. Sobre este processo, pode se
dizer que: Alternativa A: o FITC é um derivado da fluoresceína verde com excitação máxima de 633 nm e emissão máxima de 785 nm,
que apresenta coloração verde e exibe uma alta taxa de
fotodegradação. Ou Alternativa B: o FITC reage facilmente com os grupos amino dos resíduos
de lisina e produz conjugados instáveis. Ou Alternativa C: o FITC não reage com os grupos amino dos resíduos de
lisina.  Ou Alternativa D: o FITC é um derivado da fluoresceína verde com excitação máxima de 498 nm e emissão máxima de 517 nm,
que apresenta coloração verde e exibe uma alta taxa de
fotodegradação. Ou Alternativa E: as aloficocianinas (APC) com excitação máxima de 498 nme
emissão máxima de 517nm são conhecidas como
ficobiliproteinas.

Qconcursos · Accepted Answer

Alternativa [D] o FITC é um derivado da fluoresceína verde com excitação máxima de 498 nm e emissão máxima de 517 nm,
que apresenta coloração verde e exibe uma alta taxa de
fotodegradação. Tema central: Na citometria de fluxo, um laser excita fluorocromos ligados às células; estes emitem luz em comprimentos de onda maiores (deslocamento de Stokes), captada por fotomultiplicadores (PMT) através de filtros. A escolha do fluorocromo deve ser compatível com a linha do laser e o filtro de detecção, reduzindo sobreposição espectral.

Alternativa correta: D — O FITC é um derivado da fluoresceína que emite verde, com excitação máxima ~495 nm (ótima com laser azul 488 nm) e emissão ~519 nm. É reconhecido por fotodegradação relativamente alta (photobleaching) e menor brilho que PE/APC. Esses valores e características sustentam a assertiva. Referências: Shapiro HM. Practical Flow Cytometry; guias BD Biosciences/Invitrogen.

Por que as demais estão incorretas?

A — Atribui ao FITC excitação em 633 nm e emissão em 785 nm, faixa do vermelho/próximo IR. Esses números lembram fluoróforos como APC-Cy7 (emissão ~780 nm) excitados por laser vermelho (633–640 nm), e não FITC. Além disso, não corresponderia a coloração verde.

B — O FITC (grupo isotiocianato) reage facilmente com aminas primárias (p. ex., lisina) de proteínas/anticorpos formando ligações tió-ureia que são estáveis quando corretamente conjugadas e armazenadas (pH ~8,3; tampão carbonato). Dizer que produz “conjugados instáveis” é conceitualmente incorreto.

C — Afirma que o FITC não reage com aminas de lisina. Falso: essa é justamente sua principal via de conjugação em imunomarcações.

E — APC é, de fato, uma ficobiliproteína, mas sua excitação/emissão são ~650–652/660–670 nm, detectada no canal vermelho (laser 633–640 nm). Os números 498/517 nm pertencem ao espectro do FITC. Há, portanto, mistura de conceitos e valores.

Dicas para a prova: associe pares “clássicos” — FITC 488→519 (verde), PE 488→578 (laranja), PerCP 488→677 (vermelho distante), APC 633/640→660 (vermelho), APC-Cy7 633/640→~780 (IR). Verifique compatibilidade com lasers do citômetro e planeje a compensação quando houver sobreposição.

Referências úteis: Shapiro HM. Practical Flow Cytometry; BD Biosciences Fluorochrome Guide; Current Protocols in Cytometry; Invitrogen/Thermo Fisher SpectraViewer.

Gabarito: D

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