O primeiro passo da investigação consiste em excluir uso exógeno de glicocorticoides.

É necessário investigar síndrome de Cushing subclínico em todos os casos de incidentaloma adrenal com cortisol urinário de urina 24 h. 

O uso de anticoncepcionais oral pode elevar os níveis de CBG (Globulina carreadora dos corticoesteroides), e, portanto, alterar o teste da dexametasona com 1mg overnight.

Após confirmação do hipercortisolismo, é necessária a busca etiológica com solicitação do ACTH. Se o ACTH for menor que 10 pg/ml, esse nível é indicativo de Cushing ACTH independente, possivelmente de causa adrenal.

O cateterismo bilateral dos seios petrosos ajuda na diferenciação entre a doença de Cushing e a secreção de ACTH ectópico.