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 A leitura das bandas do gel de eletroforese reconstrói a sequência complementar ou a própria sequência do DNA molde de forma exata de baixo para cima (do fragmento menor ao maior).

Gabarito: alternativa A, considerando a sequência indicada no enunciado.

A) Correta — sequência de DNA obtida pelas bandas

No método de Sanger, a síntese de DNA é interrompida quando um didesoxirribonucleotídeo (ddNTP) é incorporado à cadeia em crescimento. Isso gera fragmentos de diferentes comprimentos, que são separados por eletroforese.

• Cada banda representa um fragmento de DNA que terminou em determinada base.
• A leitura é feita de baixo para cima, começando pelo fragmento menor e seguindo para os maiores.
• Identificando a base correspondente a cada banda, obtém-se a sequência da cadeia sintetizada.
• A sequência indicada na alternativa é TGGCAATACCGG.

Atenção: essa é a sequência da cadeia sintetizada que se lê no gel. Para obter a sequência da cadeia original complementar, é necessário determinar a sequência complementar e considerar a orientação antiparalela:

Se a fita sintetizada lida no gel é: 5′-TGGCAATACCGG-3′

A fita complementar, alinhada antiparalelamente, é: 3′-ACCGTTATGGCC-5′

B) Incorreta — síntese não enzimática

O método de Sanger utiliza síntese enzimática de DNA in vitro.

Isso significa que a reação ocorre em laboratório e depende da enzima DNA polimerase, responsável por adicionar nucleotídeos à cadeia de DNA.

Os componentes principais são:

• DNA molde;
• primer (iniciador);
• DNA polimerase;
• nucleotídeos normais (dNTPs);
• didesoxirribonucleotídeos terminadores (ddNTPs).

Os ddNTPs interrompem a síntese quando são incorporados, pois não possuem o grupo 3'-OH necessário para adicionar o próximo nucleotídeo.

C) Incorreta — sequência terminadora de dezenas de bases

A interrupção da síntese não depende de uma sequência terminadora com dezenas de pares de bases.

Ela ocorre pela incorporação de ddNTPs, nucleotídeos modificados que não possuem o grupo hidroxila na posição 3' da desoxirribose.

Sem o grupo 3'-OH, não é possível formar a próxima ligação fosfodiéster. Assim, a cadeia para de crescer naquele ponto.

Como os ddNTPs são incorporados em posições diferentes, formam-se fragmentos de vários comprimentos, permitindo determinar a sequência do DNA.

D) Incorreta — dificuldade de automatização

O método de Sanger foi fundamental para o Projeto Genoma Humano justamente porque pôde ser automatizado e aperfeiçoado.

O uso de ddNTPs marcados com fluorescência permitiu identificar as bases por meio de sinais de cores diferentes. Além disso, a eletroforese capilar possibilitou separar os fragmentos e detectar os sinais automaticamente.

Esses avanços aumentaram a velocidade e a capacidade de processamento do sequenciamento.