Tema central: Sequenciamento de Sanger (década de 1970), também chamado de “terminação por didesoxi”. O princípio-chave é a interrupção da síntese de DNA por didesoxinucleotídeos (ddNTPs), que não possuem a hidroxila 3’ e, ao serem incorporados, impedem a extensão da cadeia.

Alternativa correta: A - didesoxirribonucleotídeos trifosfatados.

Justificativa: No método de Sanger, a reação contém DNA molde, iniciador, DNA polimerase, dNTPs e uma pequena fração de ddNTPs (cada um marcado, atualmente, com fluoróforos distintos). Quando um ddNTP é incorporado, por não ter 3’-OH, ocorre terminação de cadeia. A mistura resulta em fragmentos de tamanhos variados, cada um terminado em um nucleotídeo específico; a leitura por eletroforese capilar/fluorescência reconstrói a sequência. Esse uso dos ddNTPs é o reagente singular do método (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1977; CLSI MM09-A2; UpToDate – DNA sequencing technologies).

Como interpretar a questão: Palavras como “principal e singular” direcionam para o componente que diferencia o método. Entre os reagentes comuns (polimerase, dNTPs), o exclusivo do Sanger é o ddNTP.

Análise das alternativas incorretas:

B - desoxirribonucleotídeos difosfatados (dNDPs): a DNA polimerase usa dNTPs (trifosfatos) como substrato. dNDPs não fornecem energia suficiente para a ligação fosfodiéster e não são o diferencial do método (Alberts, Molecular Biology of the Cell).

C - transcriptase reversa: útil para converter RNA em cDNA antes do sequenciamento, mas não é o reagente singular do Sanger. A enzima do ciclo de sequenciamento é uma DNA polimerase (p.ex., Taq modificada ou Klenow em versões clássicas).

D - ribonucleotídeos difosfatados (rNDPs): além de serem difosfatados, são ribonucleotídeos, não substratos de DNA polimerases em Sanger; quem usa ribonucleotídeos são as RNA polimerases (como NTPs, trifosfatados) para síntese de RNA.

E - luciferase: enzima de bioluminescência empregada em outros métodos, como piro-sequenciamento (detecta pirofosfato liberado), não no Sanger tradicional.

Aplicação prática em análises clínicas: O Sanger segue como padrão de confirmação de variantes em laboratórios clínicos e de genética, pela alta acurácia em alvos curtos (CLSI MM09-A2; recomendações de validação CAP/CLIA).

Pegadinha comum: confundir dNTP (substrato usual) com ddNTP (terminador). O “trifosfatado” também diferencia de “difosfatado”.

Gabarito: A

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