Sozinho não serve para diagnóstico, sempre necessita de métodos laboratoriais complementares.

A coloração diferencial alcançada no método de Gram se deve às diferenças na composição da parede celular de bactérias. As Gram-positivas possuem uma parede celular espessa de peptidoglicano e grandes quantidades de ácido teicoico ficando com a coloração rosa-avermelhada. Por sua vez, nas Gram-negativas, a camada de peptidoglicano é fina e a coloração azul-escura.

Para visualizar microrganismos no Gram, em geral, é necessária uma quantidade de cerca de 10⁴UFC/ mL. Um resultado negativo não significa necessariamente ausência de microrganismos.

Neste método, utiliza-se como corantes o cristal violeta, o lugol e a safranina ou fucsina.