havendo questionamento sobre a Gram positividade ou Gram negatividade da cultura, deve ser feita uma coloração controle paralela, com uso de culturas bacterianas conhecidas como Gram positivas, como, por exemplo, a Escheruchia coloI, e Gram negativas, como o Staphylococcus aureus.

nas bactérias Gram negativas, o tratamento com álcool-acetona não é capaz de remover o corante inicialmente aplicado à cultura devido à espessa camada de peptideoglicanas na parede celular.

após a primeira coloração, as bactérias Gram positivas formam um complexo azul intenso que não é removido pelo álcool-acetona, pois a parede celular é formada por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e polissacarídeos que impedem a retirada do complexo cristal violeta-iodo.

o descoloramento para mais ou para menos da cultura é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool-acetona, caracterizando as Gram positivas com coloração rosa ou vermelha e as Gram negativas, roxas.

as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptideoglicanas sob uma camada de lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos, que tem seus lipídeos removidos pelo tratamento álcool-acetona, aumentando a permeabilidade e permitindo a descoloração para posterior revelação.