O corante cristal violeta pode ser substituído, mantendo-se os mesmos resultados, pelo azul de bromotimol.

A safranina pode ser substituída, mantendo-se os mesmos resultados, pela eosina.

Se for realizado o teste do KOH para confirmação da coloração de Gram, as células gram-positivas serão rompidas.

Se o tratamento com solvente orgânico - geralmente acetona-etanol - for omitido, microrganismos gram-negativos serão corados como se fossem gram-positivos.