Alternativa correta: C - não precisam ser digeridos com enzimas de restrição

1. Tema central da questão:

A questão aborda o método de montagem de Gibson (Gibson assembly), uma técnica moderna de engenharia genética utilizada para unir fragmentos de DNA sem a necessidade de enzimas de restrição. Esse método é fundamental em biologia molecular, especialmente em clonagem gênica e na construção de plasmídeos, porque torna possível a junção de múltiplos segmentos de DNA de forma eficiente e versátil.

2. Resumo teórico:

O Gibson assembly consiste em misturar fragmentos de DNA que possuem regiões de sobreposição complementares (normalmente entre 20 e 40 pares de bases). Em uma única reação, enzimas específicas (uma exonuclease, uma DNA polimerase e uma DNA ligase) processam as extremidades, promovendo a união dos fragmentos de forma precisa. O grande diferencial desse método é não exigir a digestão prévia dos fragmentos com enzimas de restrição, ao contrário das técnicas tradicionais de clonagem.

Referência: Gibson, D. G. et al. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6, 343-345.

3. Justificativa da alternativa correta:

A alternativa C está correta porque, no método de Gibson, os fragmentos de DNA não precisam ser digeridos com enzimas de restrição. A montagem é baseada em regiões de sobreposição entre os fragmentos, facilitando a ligação por ação enzimática direta e dispensando o uso de restrições, sejam elas geradoras de extremidades coesivas ou abruptas.

4. Análise das alternativas incorretas:

A - precisam ser digeridos com enzimas de restrição que geram extremidades coesivas.
Errada. O método de Gibson não utiliza enzimas de restrição para criar extremidades coesivas, pois a ligação é mediada por regiões de sobreposição específicas desenhadas nos primers.

B - precisam ser digeridos com enzimas de restrição que geram extremidades abruptas.
Errada. Assim como na alternativa anterior, o método dispensa totalmente o uso de enzimas de restrição.

D - precisam ter entre 20 e 40 pares de bases.
Errada. O tamanho total dos fragmentos de DNA pode ser muito maior; o que deve ter de 20 a 40 pb são as regiões de sobreposição, não o fragmento inteiro.

E - precisam ter mais que 1000 pares de bases.
Errada. O método permite a montagem de fragmentos de variados tamanhos, inclusive menores que 1000 pb. Não há esse requisito mínimo para o tamanho total do fragmento.

5. Estratégias para interpretação:

Observe sempre termos absolutos como “precisam ser” e avalie se realmente a técnica exige aquela condição. Preste atenção em detalhes técnicos, como o uso (ou não) de enzimas de restrição, e diferencie requisitos do fragmento inteiro dos requisitos das regiões de sobreposição. Lembre-se: no método Gibson, o ponto-chave é a sobreposição e não a digestão por enzimas. Questões desse tipo costumam tentar confundir com informações de métodos tradicionais.

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