Tema central: melhora da extração de DNA em cultura celular com baixa concentração e contaminação por proteínas. Em provas, busque a alternativa que otimize a lise de membranas e a remoção de proteínas sem degradar o DNA.

Gabarito: B – Justificativa: O uso de detergentes suaves (não iônicos) na lise celular, como Triton X-100 ou NP-40, em tampões adequados (ex.: Tris-EDTA, NaCl) solubiliza lipídios de membrana e ajuda a dissociar proteínas sem cisalhar o DNA. Associar Proteinase K (geralmente a 55–60 °C) e posterior remoção de proteínas por coluna de sílica ou extração fenol/clorofórmio aumenta pureza e rendimento. Referências clássicas: Molecular Cloning (Sambrook & Russell), Current Protocols in Molecular Biology, manuais Qiagen/Thermo Fisher para purificação de DNA.

Como interpretar a questão: Palavras-chave “contaminação por proteínas” e “baixa concentração” apontam para otimizar lise controlada, proteólise e etapas de purificação. Desconfie de propostas que removam etapas essenciais (centrifugação), usem água pura ou calor excessivo.

Análise das alternativas incorretas:

A) “Evitar centrifugação” – Inadequado. A centrifugação é crucial para pelotar células, separar detritos e clarificar lisados. Em velocidades apropriadas, não reduz DNA; ao contrário, melhora recuperação. O risco é o excesso de força/vortex, que pode cisalhar DNA.

C) “Temperaturas elevadas” – Parcial e perigoso. Usa-se 55–60 °C com Proteinase K, mas altas temperaturas indiscriminadas podem desnaturar e fragmentar o DNA e aumentar atividade de DNases antes da inativação. A recomendação é temperatura moderada e controlada com tampão e EDTA.

D) “Senescência facilita” – Falso. Células senescentes tendem a ter menos proliferação, alterações cromatínicas e podem liberar nucleases, piorando qualidade/quantidade. Melhor trabalhar com células viáveis e em bom estado (confluência adequada).

E) “Usar água destilada” – Errado. É indispensável usar tampões (Tris para pH, EDTA para quelar Mg²⁺ e inibir DNases, sais para estabilidade). Água isolada favorece degradação e baixa pureza.

Boas práticas para melhorar o rendimento:

- Tampão de lise com Tris-EDTA + NaCl e detergente suave; adicione Proteinase K e, se necessário, RNase A.
- Mistura gentil (evitar vortex vigoroso) para não cisalhar DNA.
- Purificação por coluna de sílica ou fenol/clorofórmio + precipitação em etanol/isopropanol com lavagem 70%
- Manter material livre de nucleases; checar pureza por A260/A280 ≈ 1,8.

Fontes: Sambrook & Russell, Molecular Cloning; Green & Sambrook, 4th ed.; Current Protocols in Molecular Biology; Manuais Qiagen/Thermo Fisher (DNA Purification).

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