Questões da Prova FGV - 2010 - FIOCRUZ - Tecnologista em Saúde - Bacteriologia da Produção

O Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria não móvel, estritamente patogênica para os seres humanos, que se abriga comumente no trato respiratório superior. É um organismo gram negativo pleomórfico, podendo variar de pequenos cocobacilos a longos filamentos. As cepas do Hi são capsuladas ou não capsuladas. Entre as capsuladas, diferenciam-se seis sorotipos: a, b, c, d, e, f, baseados na estrutura antigênica dos polissacarídeos capsulares. Apesar de que, tanto as cepas capsuladas como as não capsuladas (não tipificáveis) podem causar doença, as do sorotipo b são responsáveis por mais de 90% das doenças severas em crianças menores de cinco anos. O polissacarídeo do tipo b é um polímero de D-ribose-ribosil fosfato, também conhecido com PRP. O polissacarídeo capsular é o principal fator de virulência das cepas capsuladas, porém existem outros como os lipopolissacarídeos, as proteases para IgA e algumas proteínas da membrana externa. O tipo b é responsável por mais de 95% das infecções invasivas devidas em crianças menores de cinco anos, sendo a meningite uma das mais graves, cujo pico de incidência ocorre entre crianças de seis meses a dois anos de idade. A meningite por Hib tem grande importância para a Saúde Pública por suas características epidemiológicas: alta letalidade nos menores de um ano e transmissibilidade favorecida em locais de aglomeração como as creches. A fonte de microorganismos invasivos é habitualmente a flora bacteriana que coloniza a nasofaringe e/ou a orofaringe. Estima-se que cerca de 3 a 5% das crianças menores de cinco anos na população geral hospedem este microorganismo na nasofaringe, enquanto que em comunicantes da mesma faixa etária, este percentual pode chegar de 14 a 22%. A colonização pode persistir na orofaringe por muitos meses. A transmissão se dá pessoa a pessoa via aerossóis e/ou secreções orais. Em geral, um período longo de portador, com colonização das mucosas respiratórias é a regra para a posterior doença invasiva.

No que tange ao desenvolvimento de vacinas contra bactérias encapsuladas como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis, o antígeno de maior eficiência para formulação de vacinas é o próprio polissacarídeo componente da capsula e principal fator de virulência. Vacinas com esta formulação são designadas vacinas de polissacarídeos. No caso específico de Hib, a vacina é então composta do polissacarídeo que corresponde a subunidade constitutuiva da cápsula. Estas vacinas não induzem a produção de anticorpos em crianças com menos de um ano, considerado grupo de alto risco, pois o sistema imunológico se encontra em processo de maturação. Quando estes polissacarídeos são conjugados quimicamente a proteínas carreadoras, os novos antígenos são capazes de serem reconhecidos pelas células T e macrófagos, gerando uma resposta imune característica dos antígenos T-dependentes e tornam-se eficientes para os grupos de alto risco.

A esse respeito, analise as afirmativas a seguir.

I. Diversos métodos de conjugação estão descritos na literatura sendo que a maioria desses métodos inclui a inserção da molécula espaçadora entre o polissacarídeo e a proteína. As principais metodologias clássicas de conjugação são: o método do brometo de cianogênio, método da carbodiimida e aminação redutiva.

II. O método do brometo de cianogênio compreende a ativação randômica das hidroxilas do polissacarídeo que podem reagir diretamente com aminogrupos (das proteínas, por exemplo) formando o conjugado ou reagir com espaçadores moleculares como as hidrazidas.

III. O método da aminação redutiva prevê a ligação dos radicais aldeídos (gerados pela oxidação das hidroxilas) ao aminogrupo da proteína formando o conjugado. Esta metodologia, muitas vezes, implica na adição de agentes bactericidas para prevenção de crescimento de bactérias que possam contaminar a solução, pois o tempo da reação para a formação do conjugado costuma ser muito curto (cerca de cinco horas).

Assinale:

A vacinação sistemática de segmentos da população implica na necessidade da produção industrial de vacinas e, portanto, no desenvolvimento de tecnologias adequadas para atender tais demandas. A meningite meningocócica é uma doença provocada pela bactéria Neisseria meningitidis, que quando entra no sangue ou fluido espinhal dá origem a uma infecção sistêmica. Este agente infeccioso é revestido com uma cápsula polissacarídica que a torna resistente ao ataque dos leucócitos. A vacina estimula a produção de anticorpos anticapsulares, promovendo uma imunidade ativa contra os sorogrupos da bactéria presentes na vacina. A vacina contra o meningococo C é composta por polissacarídeos capsulares. No tocante à bacteriologia da produção de vacinas monovalentes e bivalentes conjugadas e aos conceitos sobre purificação de polissacarídeos bacterianos, analise as afirmativas a seguir.

I. Após a fermentação a cultura é aquecida no próprio biorreator a 55ºC por 15 minutos, com o objetivo de inativar as células bacterianas. Na seqüência, dois métodos podem ser empregados para uma primeira etapa de separação do polissacarídeo: Em um deles, o polissacarídeo é precipitado juntamente com as células, por meio de um agente de precipitação e em um outro, as células são separadas primeiramente do meio por centrifugação, sendo o polissacarídeo liberado das cápsulas bacterianas para o meio, devido às forças de cisalhamento provocadas pela centrífuga.

II. Após a remoção dos fragmentos celulares, ácidos nucléicos e proteínas, tem-se uma solução parcialmente purificada que contém, nesse estágio, moléculas do polissacarídeo de interesse e de lipopolissacarídeo (endotoxina). O volume desta solução é reduzido, quer por ultrafiltração ou pela adição de acetato de sódio e precipitação com etanol na concentração final de 80%.

III. A vacina monovalente C, confere uma proteção com duração limitada, quando aplicada em crianças com menos de dois anos. Se o polissacarídeo for ligado covalentemente a determinadas proteínas, tal proteção terá maior duração. Um exemplo é a vacina constituída pelo polissacarídeo C conjugado com as proteínas de membrana bacteriana do sorogrupo B e que representa uma possibilidade promissora na imunização contra meningite B/C.

Assinale:

Após a obtenção da solução contendo a biomolécula de interesse, procede-se à sua purificação. Considerando-se as diversas propriedades, características das proteínas em solução, com base no fato de que cada proteína apresenta uma única combinação de propriedades, pode-se eleger um método (ou a seleção da seqüência de métodos de purificação) a ser utilizado para a obtenção de uma proteína em particular.

Analise as afirmativas a seguir.

I. A cromatografia de fase reversa (CFR) separa as proteínas com base nas suas hidrofobicidades relativas. Esta técnica é altamente seletiva, mas requer o uso de solventes orgânicos. Algumas proteínas são desnaturadas permanentemente por ação dos solventes e perderão a sua funcionalidade durante o processo cromatográfico; conseqüentemente este método não é recomendado para todas as aplicações, particularmente, se for necessário que a proteína-alvo retenha a sua atividade.

II. A troca iônica é o método cromatográfico mais utilizado para a purificação de proteínas, em virtude da facilidade de ampliação de escala e da vasta aplicabilidade em comparação com outros métodos cromatográficos. Uma desvantagem desta técnica é que a matriz não pode ser regenerada, pois não é possível a reconversão do contra-íon do suporte, o que onera o custo de sua operação.

III. Na separação de proteínas por eletroforese, a amostra é submetida a um campo elétrico, o qual força as proteínas carregadas eletricamente a se moverem. Se as proteínas tiverem densidades de cargas diferentes, elas irão moverse com velocidades diferentes, podendo ser separadas. Via de regra, quanto maior a massa molar da proteína, mais rápida é a sua migração. Por ser uma técnica amplamente dominada é muito utilizada em escala preparativa.

Assinale: