Os métodos de marcação imunoenzimáticos utilizam reações do tipo enzima- substrato para obterem produtos finais coloridos a partir de cromogênios incolores. Sobre essas enzimas, marque a alternativa que condiz com a seguinte características das enzimas usadas nessa técnica: caracterizada como uma única cadeia de polipeptídeo com 308 resíduos, com um resíduo N-terminal bloqueado por piroglutamato. fortemente glicosilada (18 em massa) e contém um nico grupo de protoporfirina IX como grupo prostético, dois íons de cálcio, quatro pontes dissulfeto, e oito cadeias de carboidratos N-linked. Contém um grupo de base férrica (hematina) no seu centro ativo, possuindo, em solução, cor castanha.

Em imunohistoquímica, essa enzima oxida indiretamente os cromogênios, ao reagir com o peróxido de hidrogênio. Marque a alternativa CORRETA que condiz com o texto acima. 

A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon 1984) também pode ser denominada protei n immunoblot e consiste na detecção de proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou amostras de tecidos. Com base nessa técnica, julgue as afirmativas e marque a alternativa CORRETA.

I- Os passos para a elaboração dessa técnica podem ser resumidos em cinco etapas: (1) extração e quantificação das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3) transferências dessas proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e (5) revelação dessa membrana para análise dos dados.

II- Diversos métodos espectroscópicos são utilizados para quantificar proteínas em uma solução. O ensaio de Bradford é o mais utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como a rapidez, a não exigência de aquecimento e a alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. O método de Bradford se baseia na mudança de cor do corante Coomassie Blue G-250, em solução ácida (cor azulada) para cor avermelhada na presença de proteínas. As interações hidrofóbicas e iônicas estabilizam o complexo proteína-corante.

III- Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de SDS-poliacrilamida, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão migrar. O gel é preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para retardar a migração da sua proteína de interesse. As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem.

IV- Para visualizar uma proteína de interesse, é utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um epítopo da proteína, formando um complexo anticorpoantígeno. Esse anticorpo é denominado anticorpo primário, que pode ser policlonal (reconhece mais de um epítopo) ou monoclonal (reconhece apenas um epítopo da proteína de interesse) e é geralmente obtido apenas em camundongo ou em coelho.